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Tests zur Vitalitätsansprache von holzzerstörenden Gebäudepilzen
Für diese Tests werden verschiedene Stoffwechselaktivitäten der Pilze als Hinweis auf deren Vitalität herangezogen. So werden z. B. Reduktionspotentiale mit Tetrazoliumchloriden, Membranpotentiale mit Fluoresceindiacetat und Stoffwechselprodukte wie Oxalsäure und ATP nachgewiesen.
Auswuchsversuche
Auswuchsversuche gelten auch heute noch als die zuverlässigste Methode zur Differenzierung zwischen lebenden und toten Mycelien. Eine unkonventionelle Methode, die aber schon die Einfachheit dieser Methode verdeutlicht, wird von Wünsche (1952) beschrieben: "Um beliebige Flächen eines befallenen Brettes auswachsen zu lassen, legt man dieses dicht schließend über ein Hohlgefäß mit wenig Wasser (Brett belasten). Es bildet sich dann bald im Glas ein genügender Feuchtigkeitsgehalt, der Mycelausstrahlungen an der Unterseite des Brettes hervorbringt, während der überstehende Brett-Teil unverändert bleibt". Dieser Vorgehensweise entspricht im Prinzip die Methode der Feuchtekammer, wie sie in der phytomedizinischen Diagnostik seit jeher eingesetzt wird (Hoffmann et al. 1994).
Heute wird häufig ein kleines Stück des zu untersuchenden Materials in eine Petrischale gelegt, die mit einem Nähragar gefüllt ist (z. B. ein Malz- oder Möhrenagar). Dabei sollte unter sterilen Bedingungen ein Stück aus der Mitte des befallenen Holzes herausgeschnitten werden, so kann sichergestellt werden, dass die nachgewiesenen Pilze auch im Holz waren. Diesem können noch antibiotisch wirkende Stoffe beigegeben werden (Russell 1956, Carey und Hull 1989) Ein Nachteil dieser Methode ist, daß Schimmelpilze, Hefen und Bakterien - trotz der beigegebenen antibiotisch wirksamen Substanzen im Nährboden - die Ansätze leicht zerstören können. Ein weiterer Nachteil der Auswuchsverfahren ist, daß sie längere Zeit benötigen, bis sie ausgewertet werden können. Sie wurden aber wegen ihrer relativ hohen Zuverlässigkeit und wegen fehlender verläßlicher Alternativen auch in dieser Arbeit als Referenzmethode für die anderen Verfahren gewählt.
Die Vitalfluorochromierung ist eine Anfärbung lebender Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Die Fluorochromierung hebt optisch die Merkmale hervor, die als Vitalitätsbeweise herangezogen werden können, so z. B. die Plasmaströmungen und die intakten Strukturen der Organellen. Für den holzzerstörenden Pilz S. lacrymans ist dieses Verfahren von Munck und Sundberg (1994) erprobt worden. Sie verwendeten DAPI (4´,6-diamidino-2-phenylindole) und einen Hoechst-Farbstoff (bis-benzimid H 33258), die vor allem die Kernbereiche anfärbten. Sie bezogen aber auch die Organellenstruktur in die Vitalitätsbewertung des Pilzes mit ein.
Methylenblau-Test - ein Negativtest
Der Ursprung dieses Tests scheint auf Arbeiten von Röûi¹ka zurückzugehen, die in Pflüger (1910) erstmals vorgelegt worden sind. Röûi¹ka stellt eine Doppelfärbung zur Differenzierung von toten und lebenden Geweben mit Neutralrot und Methylenblau vor, die nach Harms (1965) eine längere Zeit im Einsatz war. Lebende Gewebe färben sich danach rot, die toten nehmen den blauen Farbstoff des Methylenblaus an. Im Gegensatz dazu beschreibt Ronsdorf (1933) eine echte Vitalfärbung des Plasmas auskeimender Puccinia-Sporen sowohl mit Methylenblau wie auch mit Neutralrot. Eine andere Beobachtung beschreibt Drawert (1968, 282): "In wäßrigen Lösungen von Methylenblau färben sich nur tote Hefezellen, so daß die Anzahl gefärbter Zellen direkt als Maß für die Giftigkeit des Farbstoffes dienen kann."
Heute wird dieser Test (ohne Neutralrot) zum Teil von Sachverständigen eingesetzt, die mit ihm die Vitalität von holzzerstörenden Pilzen in Gebäuden beurteilen. Dabei wird davon ausgegangen, daß nur tote Hyphen gefärbt werden. (Der Test gilt jedoch unter Gutachtern als umstritten.)
Nachweis von Oxalsäure - Nachweis eines sekundären Stoffwechselproduktes
Dieser vom Wilhelm-Klauditz-Institut (WKI) abgewandelte Test ("WKI-Test") beruht auf einem Farbumschlag zweier Farbindikatoren, des Bromkresolgrüns und des Bromphenolblaus, von Blau nach Grün zu Gelb. Der Test macht sich den Umstand zunutze, daß holzzerstörende Pilze Oxalsäure produzieren, und Braunfäule-Erreger, im Gegensatz zu Weißfäule-Erregern, diese nicht weiterverarbeiten können. Die Oxalsäure sammelt sich an und kann nachgewiesen werden (Bruhn 1993). Dieser Test soll die Aktivität von S. lacrymans und Coniophora puteana anhand von Luftmycel nachweisen können. Er kann am Befallsort eingesetzt werden. Ein Problem bei diesem Test könnte die in Kristallform eingelagerte Oxalsäure in toten Hyphen sein.
Der ursprünglich von Peek und Willeitner (1980) entwickelte Test kann als Indikator für den generellen Abbau braunfaulen und z. T. auch weißfaulen Holzes genutzt werden. Mit ihm wird aktiver oder bereits abgestorbener Pilzbefall lokalisiert, bevor er makroskopisch offensichtlich geworden ist. Zu Fehldiagnosen kann es an stark sauren Nadelhölzern, so z. B. an Douglasie (Pseudotsuga menziesii), und bei Auswaschung der Oxalsäure kommen, worauf Peek und Willeitner ausdrücklich hinweisen.
ATP-Test - Nachweis primärer Stoffwechselaktivität
Bei diesem Test wird ATP nachgewiesen. Hierzu mußten früher die Proben gereinigt, die Hyphen aufgeschlossen und das ATP isoliert werden (Weidmann et al. 1990).
Neuere Methoden, die mit S. lacrymans durchgeführt wurden, basieren auf einer Lumineszenz-Reaktion des Enzyms mit einer Luciferase und ATP, die mittels eines Luminometers nachgewiesen wird. Auf eine langwierige Aufreinigung kann aufgrund der sehr hohen Nachweisgrenze verzichtet werden (Munck und Sundberg 1994). Diese Methode weist ATP unabhängig von seiner Herkunft nach; ob es von Bakterien, Schimmelpilzen oder von der gesuchten Pilzart stammt, kann also nicht unterschieden werden. So sind im Voraus mikroskopische Untersuchungen nötig, die klären, ob die untersuchten Hyphen nicht einen sekundären Befall aufweisen.
Bei den im folgenden beschriebenen Verfahren handelt es sich um Vitalitätstests, die noch nicht an Gebäudepilzen überprüft worden sind und hier auf holzzerstörende Pilze übertragen werden sollen.
"TTC-Tests" - Nachweis primärer Stoffwechselaktivität des Zitronensäurezyklus
Vitalitätstests, die auf Tetrazoliumchloriden beruhen und bei denen meist das TTC (Triphenyl-tetrazoliumchlorid) eingesetzt wird, sind seit 1948 Standard in der Saatgutprüfung. Die besondere Eigenschaft einiger Tetrazoliumsalze wurde durch Tetrazolium-Mutagenitätstests entdeckt, bei denen sich die eingesetzten Kulturalgen nicht grün, sondern rot färbten (zur Geschichte siehe Altman 1976). Der Nachweis von Vitalität basiert bei diesem Verfahren auf der Stoffwechselaktivität der Mitochondrien bei Eukaryonten. Hierbei wird im Tricarbonsäure-Cyclus (Citratcyclus) an der Stelle, an der normalerweise Succinat zu Fumerat unter "ATP-Verbrauch" reduziert wird, das farblose Tetrazolium zu dem farbigen Formazan reduziert (Altman 1976). Das reduzierende Enzym ist die Succinat-Thiokinase (Schlegel 1992).
Diese Methode wurde von Ruetze und Liese (1985) aufgegriffen und zum Nachweis lebender Holzparenchymzellen mit einer 1%igen TTC-Lösung abgewandelt. Sie machen auf mögliche Fehlinterpretationen aufmerksam, die durch sekundären Bläuepilzbefall (Pesotum piceae, Ophiostomataceae) verursacht werden können. Demnach können Bläuepilze TTC reduzieren.
Auch die Beteiligung von Mikroorganismen an der fortschreitenden Gesteinszerstörung von Sandstein wurde mit einem Tetrazolium an historischen Bauwerken nachgewiesen (Quader und Bock 1995, Knötzsch 1997). Genutzt wird hierzu CTC (Cyano-ditolyl-tetrazolium-chlorid), ein Tetrazolium, das rot fluoresziert, nachdem es durch dehydrogenaseaktive Zellen reduziert wurde. Auf diese Weise können stoffwechselaktive Bakterien im Stein nachgewiesen werden. Knötzsch (1997) untersuchte auf diese Weise neben der Häufigkeit von Mikroorganismen im Gestein auch den Einfluß von Temperatur und Feuchtigkeit auf die Stoffwechselaktivität dieser Organismen.
Zudem kann man Tetrazoliumchloride zur Bestimmung von Redoxpotentialen und deren räumlicher Orientierung in der Zelle nutzen. Dies gelingt, weil gebildetes Formazan am Ort seiner Reduktion liegen bleibt und dort nachgewiesen werden kann (Rotman und Papermaster 1966). Später sind hierzu auch Arbeiten bekannt geworden, die sich mit Pilzen und insbesondere mit holzzerstörenden Basidiomyceten beschäftigen (Cooperman 1991 und Hirai 1995).
Alle beschriebenen Tests sollen im Rahmen dieser Arbeit nachvollzogen und miteinander verglichen und beurteilt werden. Ausgeklammert wurde lediglich der ATP-Nachweis, weil dieser aufwendige Test im Rahmen dieser Arbeit zu zeitaufwendig erschien. Er ist auch am wenigsten praxisgerecht.