Es ist möglich, an Hyphen der untersuchten Pilze allein aufgrund der geordneten "Vakuolenstruktur" zu unterscheiden, ob sie am Leben oder tot sind (s. Animation (554 KB), Abb. 76 ff. und Abb. 30 ff.). Bei Mycel mit relativ wenig lebenden Hyphen besteht allerdings die Gefahr, diese wenigen zu übersehen, was zwei Gründe hat:

1. Die Mycelien aus den Stichproben müssen alle einzeln beobachtet werden können. Das bedeutet, daß sie stark zerzupft werden müssen. Dabei werden immer einige Hyphen zerrissen. Es sterben also um so mehr Hyphen ab, je besser die Proben ausgebreitet werden. Diese Gefahr ist bei älterem Material mit einem kleineren Anteil lebender Hyphen besonders groß, da sie erfahrungsgemäß besonders stark ineinander verwoben sind.
2. Nicht bei allen lebenden Hyphen ist die Vakuolenstruktur deutlich erkennbar, besonders Wachstumsbereiche wie Hyphenspitzen und einige Schnallen weisen weniger oder keine Vakuolen auf (s. Abb. 64 und Abb. 99 (Bild, 210 KB)).

Durch die Vitalfärbungen treten die genannten Strukturen deutlicher hervor. Die zwei oben genannten Argumente gelten dennoch in etwas abgeschwächter Form weiter. Denn es müssen immer noch alle Hyphen einzeln beobachtet werden. Eine derartige Vorgehensweise ist allerdings ungeeignet für Differenzierungsuntersuchungen, da das Auffinden der hierfür maßgeblichen Strukturen trotzdem nicht gesichert ist.

Dies gilt jedoch nicht mehr für das gefundene Vitalfluorochrom Fluoresceindiacetat (FDA), da dieser Farbstoff selektiv nur die lebenden Hyphen anfärbt und nur diese dann fluoreszieren.

Anstatt der verschiedenen Farbstoffe wurde verstärkt FDA untersucht und aufgrund seiner guten Eigenschaften als Referenzmethode für die anderen, nicht auf Auswuchs basierenden Tests eingesetzt. Deshalb sind die Untersuchungen der einzelnen Vitalfarbstoffe an Mycel weit lückenhafter als die der zuerst unternommenen Holzfärbungen.

Die Färbemethode mit FDA geht auf Untersuchungen an tierischen Zellen mit reinem Fluorescein von Ellinger und Hirt (1929) zurück. An pflanzlichen Zellen (meist Allium cepa L.) sind entsprechende Versuche - auch noch mit Fluorescein - von Döring (1935), Strugger (1938) und Höfler et al. (1954) durchgeführt worden, die nachweisen, daß Fluorescein nur lebendes Plasma anfärbt. Erst in späteren Jahren benutzten z. B. Weber et al. (1992) FDA zur Ansprache von fünf definierten Vitalitätsstufen von Mykorrhizen.