Spektralanalyse der verwendeten Vitalfarbstoffe
Anhand der Absorptionsspektren ist der Einfluß von Lösungsmitteln und der des pH-Wertes auf die Vitalfluorochrome bestimmt worden, um erstens die interessantesten pH-Bereiche für die späteren Untersuchungen am CLSM herauszufinden und zweitens jene Farbstoffe zu ermitteln, deren Absorptionsspektren weitgehend mit dem Filtersatz des CLSM übereinstimmen.
Von den Vitalfarbstoffen wurde je pH-Wert ein Spektrum aufgenommen. Von den Farbstoffen, die erst nach einer Molekülveränderung oder -spaltung fluoreszieren, wurden sowohl Spektren von dem nicht fluoreszierenden Farbstoff als auch von dem fluoreszierenden Spaltungsprodukt aufgenommen (z. B. bei Fluoresceindiacetat = FDA). Das Spaltungsprodukt des FDA ist Fluorescein. Reines Fluorescein stand nicht zur Verfügung, so daß alternativ Fluoresceinthiocyanat benutzt wurde, um ein Spektrum von Fluorescein zu erhalten, da Fluoresceinthiocyanat, in Wasser gelöst, unter leichtem Erwärmen Fluorescein abspaltet.
Nach Drawert (1968, 139) hängt der Farbton eines Fluorochroms von der Polarität des Lösungsmittels ab. Deshalb wurden bei zwei Farbstoffen (Acridinorange und FDA) Meßreihen mit zwei unterschiedlichen Lösungsmitteln (H2O und 1% DMSO in H2O) durchgeführt.
Zur Darstellung der Diagramme wurden dreidimensionale Grafiken gewählt, bei denen sich die unterschiedlichen pH-Werte besser erfassen lassen. Allerdings sind die einzelnen Werte nicht so klar zu erkennen, wie es bei einer zweidimensionalen Darstellung möglich wäre (s. Diagramme in Abschnitt 7.3)
Spektralmessungen
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Spektralphotometer: |
Unikon 931 Spectrophotometer (Kontron Instrumens) |
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Erfaßter Spektralbereich: |
190 nm - 800 nm |
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Auflösung: |
je nm ein Meßwert (1/nm) |
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Lampenwechsel: |
zwischen Deuterium- und Halogenlampe bei 340 nm |
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Gitterspalte: |
2 nm breit |
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Messungen: |
5 je Farbstoff (pH 3, 5, 7, 9, 12) |
Autor: T. Huckfeldt