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Konfokale-Laser-Raster-Mikroskopie

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Anfärbeverfahren für Pilzmycel zum Zwecke des Mikroskopierens

Historischer Rückblick

Die Geschichte der Mikrofarbstoffe beginnt kurz nach der Erfindung des Mikroskops durch
Z. Janssen 1590 bzw. M. Hook 1665. An dieser Stelle seien nur einige wenige Stationen genannt, welche die sich gegenseitig inspirierenden Entwicklungen umreißen.

Grundlage für die Zusammenstellung waren Harms (1965), Drawert (1968), Meyers Taschenlexikon (1990) sowie Engelhart und Knebel (1995).

  1. Reichel färbt als eines der ersten botanischen Objekte Bohnensamen mit abgekochtem Fernambukholz (Caesalpinia echinata und brasiliensis, Caesalpiniaceae). Er beschreibt die Gefäße.
  1. J. Dolland entwickelt ein erstes achromatisch korrigiertes Linsensystem.
  1. G. B. Amici führt das Immersionsobjektiv und die halbkugelförmige Frontlinse ein.
  1. Die erste Vitalfärbung, eine diffuse Vakuolenfärbung, wird an pflanzlichen Zellen von F. Unger angefertigt. Er färbt ganze weißblühende Hyazinthen mit angegorenen Fruchtsäften von Phytolacca an.
  1. In diesem Jahr wird die erste "vitale" Kernfärbung von Osborne mit Carmin an Weizenpflanzen durchgeführt. (Bei späteren Versuchen gelingen keine Vitalfärbungen im Sinne der oben angeführten Definition (Drawert 1968).)
  1. Beneke verwendet als erster einen Anilinfarbstoff. Eine rasche Entwicklung dieser neuartigen Farbstoffe setzt ein.
  1. Die ersten wahrscheinlich wirklich vitalen Kernfärbungen gelingen Brandt mit Hämatoxylin an Protisten.
  1. Pfeffer führt grundlegende botanische und systematische Arbeiten zur Vitalfärbung aus. Diese können als Ausgangspunkt der Vitalfärbung gelten.
  1. O. G. Heimstädt und C. Reichert stellen ein Fluoreszenzmikroskop vor.
  1. Haitinger und Hamperl sowie Linsbauer führen die ersten systematischen Fluoreszenzfärbungen in der Histologie bzw. Botanik durch.
  1. Das von Zernike 1934 entwickelte Phasenkontrastmikroskop kommt auf den Markt.
  1. Vergabe des ersten US-Patentes (3,013,467), das ein konfokales Mikroskop beschreibt, an Minsky. Es fehlt jedoch an Lichtquellen, die stark genug sind.
  1. Erst zehn Jahre später werden die ersten optischen Schnitte von Egger und Petran veröffentlicht. Die Bilder müssen zweidimensional bleiben, es fehlen Computer.
  1. V. Brakenhoff et al. stellen ein konfokales Mikroskop mit Objektiven von höherer numerischer Apertur vor, das eine gesteigerte Auflösung hat. Es hält Einzug in die Augenheilkunde, da Endothelzellen am Patienten untersucht werden können.
  1. Alle Schlüsseltechniken zur Erstellung von dreidimensionalen Bildern sind verfügbar: ausgereifte Optik, leistungsstarke Lichtquellen, Detektoren und Computer sowie neuartige Fluoreszenzmarker.

Konfokale-Laser-Raster-Mikroskopie als Sonderverfahren

Das CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope) ist meist ein Fluoreszenzmikroskop, bei dem ein Laser als Lichtquelle genutzt wird. Das konfokale Prinzip besteht darin, daß nur ein Punkt, der genau in der Schärfenebene liegt, beobachtet wird. Der unscharf erscheinende Hintergrund wird durch zwei Blenden (Pinholes) ausgeblendet. Rastern/Scanning bedeutet, daß die Bilder Punkt für Punkt eingelesen und per Computer weiter verarbeitet werden (Engelhart und Knebel 1995).

Mit Hilfe des CLSM ist die Möglichkeit eröffnet, ohne großen präparativen Aufwand, schnell und sehr gut vergleichbar die Fluoreszenzeigenschaften von Vitalfluorochromen zu untersuchen, da die subjektive Einschätzung der Farbintensität durch den Betrachter und das störende Hintergrundbild entfallen. Dies ist möglich, indem die gewonnenen Daten / Bilder direkt auf dem Bildschirm gegenübergestellt werden können.

Das CLSM läßt sich allerdings auch einfach wie ein erweitertes Fluoreszenzmikroskop nutzen. Jedoch müssen bei der Übertragung auf ein normales Fluoreszenzmikroskop Abstriche in der Auflösung hingenommen werden, da nach Engelhart und Knebel (1995) die Auflösungsgrenze des CLSM um den Faktor 1,4 höher liegen kann als bei einem herkömmlichen Mikroskop.

Die Möglichkeit der realen dreidimensionalen Auflösung kann in holzigen Geweben, anders als beispielsweise im Quarzgestein, nicht voll ausgenutzt werden, da die celluosehaltigen Zellwände nicht vom Laserlicht durchdrungen werden können. Trotzdem können Hyphen in aufgebrochenen Gefäßen und Tracheiden oberflächlich - dreidimensional dargestellt werden.

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Autor: T. Huckfeldt

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