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CLSM

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Anfärbeverfahren entwickelt, mit dem selektiv lebende Zellen bzw. Hyphen fluorochromiert werden können. Das Verfahren basiert auf der Spaltung von Fluoresceindiacetat (FDA) durch lebende Zellen und auf der Anreicherung des abgespaltenen Fluoresceins im Plasma. Die Fluoreszenz des Fluoresceins kann dann mit dem Konfokalen-Laser-Raster-Mikroskop (CLSM) in den Hyphen nachgewiesen werden. Neben Oberflächenmycel kann das Verfahren auch auf Hyphen holzabbauender Pilze im Holz angewendet werden, da FDA Holz nicht anfärbt.

Zum Auffinden eines geeigneten Vitalfluorochroms wurden 14 ausgewählte Farbstoffe spektrometrisch bei fünf pH-Werten untersucht, die Wirkung der Vitalfluorochrome auf zwei Holzarten geprüft und ihre Wirkung auf verschiedene Kulturmycelien getestet. Das FDA wurde an 12 Reinkulturen holzzerstörender Pilzarten, darunter sechs Prüfstämme des Echten Hausschwammes (S. lacrymans), und Mycelproben aus acht Gebäuden überprüft.

In befallenen Gebäuden wurde die Verteilung lebender Hyphen untersucht, um optimale Entnahmestellen aufzeigen zu können. Hierbei zeigte sich, daß Luftmycel ungeeignet ist, um Aussagen über die Vitalität von Mycel des Echten Hausschwammes zu treffen. Zur Begutachtung des Hausschwammes sollten verdeckt liegende, kräftige Mycelstränge oder Mycellappen bzw. Zwischenmycel von feuchten, ebenfalls verdeckt liegenden Stellen entnommen und innerhalb von ca. 10 Stunden untersucht werden. Denn die Hyphen von S. lacrymans leben unterschiedlich lang: Faserhyphen sterben nach ihrer Ausdifferenzierung ab. Grundhyphen wachsen ständig weiter, sie werden bei Zimmertemperatur ein bis max. drei Monate alt. Das Mycel bleibt nur durch ständiges Weiterwachsen am Leben. Basidiosporen können in ihrer Ruhephase mit FDA nicht als lebend nachgewiesen werden.

Im einem zweiten Teil wurden bekannte schnelle Vitalitätstests für holzzerstörende Pilze mit dem FDA-Verfahren auf ihre Aussagekraft hin überprüft. Daneben wurde ein neuer Ansatz für einen Schnelltest überprüft, der auf der Reduktion von Iodonitro-tetrazolium-violett (INT) zu Formazan durch die lebenden Hyphen basiert.

Als ungeeignet erwies sich Methylenblau, da es lebende und tote Hyphen anfärbte und bei keiner untersuchten Konzentration zufriedenstellende Ergebnisse gefunden werden konnten.

Nur sehr bedingt geeignet waren der Oxalsäurenachweis und die Versuche mit INT. Beide ergaben nur mit kräftig wachsenden Mycelien einen sicheren Vitalitätsnachweis. Bei schwach wachsenden Mycelien konnte makroskopisch nicht zwischen lebenden und toten Hyphen differenziert werden. Da es jedoch möglich ist, das aus INT gebildete Formazan mikroskopisch nachzuweisen, war der INT-Test als mikroskopischer Test geeignet, lebende Hyphen von toten zu unterscheiden. Beim Oxalsäurenachweis war dies nicht möglich.

Insgesamt erwies sich das Färbeverfahren mit FDA als am besten geeignet, Aussagen über die Vitalität von holzzerstörenden Pilzen zu treffen.

Parallel dazu wurden Elektronenmikroskopische Untersuchungen von lebenden Hyphen verschiedenen Alters sowie von toten und durch Hitze abgetöteten Mycelien durchgeführt. Dabei zeigten tote Hyphen immer gleiche Strukturen. Die gefundenen Plasmareste, Membranringe und eingedrückten Zellwände konnten gut mit den lichtmikroskopisch beobachteten Strukturen verglichen werden. Auch die lebenden Hyphen zeigten licht- und elektronenmikroskopisch vergleichbare Strukturen wie Vakuolen, einen der Zellwand eng anliegenden Zellinhalt, Zellkerne, und einen intakten Plasmastrang. So konnten die Ergebnisse der lichtmikroskopischen Untersuchungen abgesichert werden.

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Autor: T. Huckfeldt


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