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Fixieren und Einbetten

Es sollte folgendermaßen verfahren werden:

  1. Frisches Mycel aus den Kulturen abzupfen und sofort in Schnappdeckelgläser überführen
  2. Für 60-70 Min. Glutaraldehydfixierung (2,5 %, pH 7) in Cacodylatpuffer (100 mM, pH 7,2)
  3. 1x waschen in Pi-Puffer (100 mM, pH 7,2)
  4. In eine gerade noch flüssige, 2%ige Agarlösung im Verhältnis 1:1 einmischen, auf Eis stellen und nach dem Erstarren in Würfel schneiden
  5. In Schnappdeckelgläsern 3x mit Pi-Puffer (100 mM, pH 7,2) waschen
  6. OsO4-Fixation (2%, in Cacodylatpuffer, 100 mM, pH 7,2), für 14 Stunden über Nacht im Kühlschrank bei ca. 4°C einwirken lassen
  7. 3x waschen in Cacodylatpuffer (100 mM, pH 7,2)
  8. Entwässerung mit Aceton und Einbettung in Spurrgemisch in stufenweise ansteigenden Konzentrationen, siehe Tab. VIII
  9. Tab. VIII: EM-Einbettung

     

    Cacodylatpuffer: Aceton (Entwässerung)

    Aceton + Spurrgemisch

    Zeit [h]

    1/4

    1/4

    1/4

    1/4

    1/4

    1/4

    ¯

    1

    1

    14*

    4

    Verdünnung

    15:85

    30:70

    50:50

    75:25

    90:10

    2x 100

    3x 100

    75+25

    50+50

    25+75

    100

    *) Hierbei wurden die Schnappdeckelgläser nicht fest verschlossen, so daß das Aceton verdampfen konnte. So verblieb im Schnappdeckelglas bis zum nächsten Morgen ein 100%iges Spurrgemisch.

  10. Einbetten mit Spurr in Gelatinekapseln, polymerisieren im Wärmeschrank bei 69°C für 26 h und abkühlen über ca. 24 h (Robinson et al. 1985)

Chemikalien für die elektronenmikroskopische Präparation

Bleicitrat:

Nach Reynolds (1963) werden 1,33 g Pb(NO3)2 und 1,76 g Na3(C6H5O7) [2 H2O] zu 30 ml frisch abgekochtem Wasser gegeben. Während eines 30minütigen Schüttelns entsteht aus Bleinitrat Bleicitrat.

Cacodylatpuffer:

(C2H6AsNaO2×3H2O)

Formvar:

0,4%ige Lösung in Chloroform

Glutaraldehyd:

2% (C5H8O2) [giftige Dämpfe]

Osmiumtetroxid:

2% (OsO4) in Wasser, eine schwache Osmiumsäure (H2OsO5) entsteht [sehr giftig (t+) - giftige Dämpfe]

Spurr-Einbettung:

Spurr (1969), (LVG = Low Viscosity Gemisch), Zusammensetzung:

 

 

5,0 g VCD (E.R.L. 4206, Vinycyclohexendioxid)

 

 

3,0 g D.E.R. 736 (Diglycidäther von Propylenglycol = Weichmacher)

 

 

13,0 g NSA (Nomenyl-Bernsteinsäureanhydrid = Härter)

 

 

0,2 g DMAE (S-1, Dimethylaminoethanol = Beschleuniger)

Uranylacetat:

In Aqua bidest. angesetzte, gesättigte Lösung wird verwendet (lichtempfindlich).

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Autor: T. Huckfeldt


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